Proteinquantifizierung

Die Proteomanalyse hat es sich zur Aufgabe gemacht eine Vielzahl von Proteinen in komplexen Mischungen zu charakterisieren. Hierzu gehört neben der Identifizierung der Proteine auch deren Quantifizierung. Zu diesem Zweck werden am Molecular Proteomics Laboratory sowohl Gel- als auch MS-basierter Methoden eingesetzt, die in Lage sind die Abundanz der Proteine sehr genau zu bestimmen. Durch den gezielten Einsatz der Methoden ist es unter anderem möglich, Aussagen über die Dynamik der Produktion sowie des Abbaus von Proteinen als auch die Stöchiometrie von Proteinkomplexen und Biomarkern im Blut zu machen.

Label-free

Die labelfreie Quantifizierung kommt, wie der Name schon vermuten lässt, ohne eine zusätzliche Markierung der Analyten aus. Grundlage bildet die Tatsache, dass Peptide zwar unterschiedlich gut ionisierbar sind, die Signalintensität eines Peptids im Massenspektrometer aber dennoch mit seiner Konzentration in der Probe korreliert. Somit ist es möglich anhand seiner Signalintensität (genauer: der Fläche unter der Kurve)  ein bestimmtes Peptid über mehrere Proben hinweg relativ zu quantifizieren. Voraussetzung dieser Methode sind eine sehr gut reproduzierbare Chromatographie sowie Massenspektrometrie. Andere Ansätze nutzen nicht direkt die MS-Signalintensität, sondern die Anzahl der identifizierten Spektren je Peptid. Dies schließt die zusätzliche Annahme mit ein, dass die Chance einer datenbankbasierten Identifizierung  eines Peptides mit seiner Konzentration in der Probe steigt.


Vorteile dieser Art der Quantifizierung sind ihr sehr sparsamer Materialverbrauch (200-500 ng je Probe), niedrige Kosten verglichen mit label-basierten Ansätzen und ist durch den Wegfall eines Markierungsschritt schneller durchführbar. Sie eignet sich besonders wenn eine größere Anzahl von Proben quantifiziert werden sollen und/oder, wie im Falle von z.B. humanem Gewebe, ein metabolisches Labeling nicht in Frage kommt.

Literatur

Quantitative profiling of proteins in complex mixtures using liquid chromatography and mass spectrometry. Chelius D et al. J Proteome Res. (2002) Jul-Aug;1(4):317-23.

Quantitative proteomic analysis by accurate mass retention time pairs. Silva JC et al. Anal Chem. (2005) Apr 1;77(7):2187-200.

SILAC

Das Kürzel SILAC steht für “stable isotope labeling by amino acids in cell culture”. Bei diesem Verfahren werden Proteine metabolisch durch den Einsatz von Aminosäuren markiert, die schwere Isotope enthalten. In der Regel erfolgt die Markierung in Zellkulturen, es lassen sich aber auch die Proteine ganzer Organismen wie Maus oder Drosophila markieren. In der Regel werden Lysin und/oder Arginin für die Markierung eingesetzt und die untersuchten Proteome vor der Analyse verdaut, so dass eine Quantifizierung auf der Ebene von Peptidsignalen im Massenspektrum erfolgt. Peptide, die mit „schweren Aminosäuren“ markiert wurden unterscheiden sich in ihrer Isotopenzusammensetzung, verhalten sich aber während der Probenpräparation, Auftrennung und massenspektrometrischer Analyse wie ihre „leichten“ Gegenstücke. Die relativen Verhältnisse der Peptidsignale im Massenspektrum korrelieren direkt mit dem Verhältnis der zu vergleichenden Peptide aus der Probe. Mit geeigneter Software lassen sich die relevanten Signale extrahieren und Peptidverhältnisse errechnen.


Die metabolische Markierung durch stabile Isotope eröffnet noch einige weitere Möglichkeiten. So lassen sich durch den Einsatz verschiedener Isotope nicht nur zwei sondern auch drei und mehr verschiedenen Proben gleichzeitig in einem LC-MS Lauf analysieren.

Außerdem lassen sich isotopenmarkierte Peptide als „Spike-In“-Standard verwenden und können gemeinsam mit unmarkierten Proben gemessen werden. Dieser Ansatz findet Verwendung wenn Organismen oder anderes Probenmaterial nicht direkt markiert werden kann (z.B. bei primärem Humangewebe). Durch den relativen Bezug zum Standard ist der quantitative Vergleich von mehreren unmarkierten Proben untereinander möglich.

Eine weitere Anwendung ist das sogenannte „Pulsed-Labeling“. Durch die Umstellung des Angebots an isotopenmarkierten Aminosäuren kann auf Ebene von massenspektrometrischen Untersuchung die Synthese und der Umsatz von Protein in Zellen und Organismen analysiert werden.

Literatur

Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.

Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Mol Cell Proteomics. 2002 May;1(5):376-86.

Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.

Ong SE, Mann M. Methods Mol Biol. 2007;359:37-52.

Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue.

Geiger T, Cox J, Ostasiewicz P, Wisniewski JR, Mann M. Nat Methods. 2010 May;7(5):383-5.

Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC.

Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M. Proteomics. 2009 Jan;9(1):205-9.

SRM

Selected Reaction Monitoring (SRM) oder auch Multiple Reaction Monitoring (MRM) genannt ist eine massenspektrometrische Methode zur gezielten Analyse von kleinen Molekülen und Peptiden. Diese Art der Analyse wird mit Hilfe von Triple Quadrupol Massenspektrometern (QQQ), wie der TSQ Vantage, durchgeführt.


Für die SRM-Analyse müssen die Massen der zu analysierenden Ionen (precursor), sowie die Massen der Fragmentionen bekannt sein. Mit Hilfe dieser Informationen können nun die so genannten Übergänge (transitions) erstellt werden. Hierbei werden im ersten Quadrupol (Q1) die zu analysierenden Ionen selektiert und im zweiten Quadrupol (Q2) mittels Collision-Induced Dissociation (CID) fragmentiert. Im dritten Quadrupol (Q3) werden nun die Fragmente selektiert und anschließend detektiert. Mittels der zweimaligen Selektion der Ionen kann eine sehr hohe Empfindlichkeit, durch ein niedriges Signal zu Rausch Verhältnis erreicht werden. Zudem wird mittels SRM ein hoher dynamischer Bereich abgedeckt.

Die Analyse der Übergänge ermöglicht den gezielten Nachweis von kleinen Molekülen und Peptiden im Attomol-Bereich auch in komplexen Matrices, wie beispielweise Serum oder Plasma. Die die Analyse mehrerer biologischen Replikate ermöglicht eine label-free  relative Quantifizierung oder mit einem zugemischten Peptidstandard auch eine absolute Quantifizierung von Peptiden oder Proteinen. Dieser Peptidstandard besteht aus den zu quantifizierenden Peptiden, welche schwere Isotopen markierte Aminosäuren (meist Lysin oder Arginin) beinhalten.

Vorteile der SRM-Analyse sind der hohe dynamische Bereich bei der Quantifizierung und die sehr hohe Sensitivität mit welcher kleine Moleküle und Peptide nachgewiesen werden können. Zudem liefert das Triple Quadrupol Massenspektrometer reproduzierbare Ergebnisse. Daher wird die SRM-Analyse häufig zur Validierung von Kandidatenproteinen verwendet, da ein hoher und stabiler Durchsatz erzielt werden kann.

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