Proteinidentifizierung

Seit der Entwicklung schonender Ionisierungsmethoden (MALDI, ESI) ist das Hauptanwendungsgebiet der Massenspektrometrie die Identifizierung von Proteinen. Das Einsatzgebiet reicht hierbei von der Bestimmung eines einzelnen Proteins (z.B. zur Kontrolle einer Überexpression) hin zur parallelen Identifizierung von mehreren tausend Proteinen in einer hochkomplexen Probe. Je nach Beschaffenheit und Komplexität der Probe reicht dabei die einfache Bestimmung der Gesamtmasse des Biomoleküls zu dessen Identitätsaufklärung nicht aus und es werden weitere Informationen benötigt. Durch den Einsatz unterschiedlicher Analyseverfahren (Peptidmassen-Fingerprint- (PMF) oder Peptidfragmentmassen-Fingerprint-Analyse (PFF)) in Kombination mit den verschiedensten Fragmentierungstechniken (CID, HCD, ETD etc.) können geringste Mengen an Proteine (pmol bis fmol) identifiziert werden.

PMF

Ist das Genom des untersuchten Organismus bekannt, kann die Proteinidentifizierung anhand des Peptide Mass Fingerprints (PMF) durchgeführt werden. Hierzu wird durch chemische oder enzy­matische Proteolyse der zu analysierenden Probe ein Gemisch aus Peptiden gewonnen und mittels Massenspektrometrie vermessen. Das dabei entsehende Signalmuster der Peptide ist, wie ein Fingerabdruck, charakteristisch für das verdaute Protein. Über einen Datenbankabgleich dieser PMF-Spektren mit bekannten und vorhergesagten Sequenzen erfolgt anschließend die Identifizierung. Je nach Massengenauigkeit können Proteine bereits aufgrund weniger Daten (3 bis 10 Peptidmassen) signifikant identifiziert werden. Der Nachteil von PMF ist, dass sich in komplexeren Proben die Anzahl der zu analysierenden Moleküle derart erhöht, dass eine PMF-Analyse nicht mehr durchführbar ist. Daher eignet sich diese Methode in erster Linie für niedrig komplexe Proteinmischungen  (ein bis drei Proteine).

MS/MS

Liegen komplexe Proteinmischungen vor oder möchte man die Sequenz einzelner Peptide für die detaillierte Charakterisierung von z.B. posttranslationalen Modifikationen (Phosphorylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung etc.) bestimmen oder möchte man Proteine von Organismen mit unbekanntem Genom per de novo Analyse identifzieren, können die proteolytischen Peptide im Massenspektrometer fragmentiert werden. Hierbei wird, nach erfolgter Gesamtmassenbestimmung, das Peptidion durch energetische Anregung sowie Kollision mit Gasmolekülen in seine Einzelbestandteile zerlegt. Die Fragmentanalyse basiert auf der Tatsache, dass Peptide je nach eingesetzter Fragmentierungstechnik (hierbei stehen mit CID, HCD, ETD etc. diverse Möglichkeiten zur Auswahl) überwiegend an definierten Stellen im Peptidrückgrat brechen.  Die Massenbestimmung der resultierenden Bruchstücke liefert nun die benötigten Informationen um die ursprüngliche Sequenz zu rekonstruieren. Auf diese Weise können z.B. auch Informationen über die Lokalisation einer posttranslationalen Modifikation gewonnen werden.

Verantwortlich für den Inhalt: E-Mail sendenRedaktionsteam BMFZ